细菌人工染色体

什么是向量？

载体是 DNA 的一个片段，用于将外源遗传物质转运到宿主细胞中，在那里它可以复制并表现出遗传表达。存在各种类型的载体来执行转化、接合和转导过程。这些载体包括质粒、粘粒和人工染色体。

载体用于不同目的。它们可分为两类：表达载体和转录载体。表达载体是指用于表达目标基因的载体，而转录载体是指用于转录目标基因的载体。穿梭载体是指能够在一个以上的宿主细胞中表达自身的载体。

载体用于几个过程。转化是将载体插入细菌，将载体插入病毒称为转导。

包含较大基因序列并能表达它们的载体称为人工染色体。人工染色体有三种类型：细菌人工染色体 (BAC)、酵母人工染色体 (YAC) 和人类人工染色体 (YAC)。

细菌人工染色体

细菌人工染色体或 BAC 是一种环状 DNA 质粒，由大肠杆菌的复制起点构建。F' 作为一种染色体外质粒存在。

BAC 被开发为第一个大片段克隆系统，用于构建 DNA 文库以分析基因组数据。细菌人工染色体是为了研究疱疹病毒等病毒的遗传和功能而开发的。由于 BAC 技术已在遗传学的各个领域得到推广，例如在遗传指纹、人类基因组测序、疫苗开发和转基因技术中。

细菌人工染色体是一种基于 F 质粒（F 质粒）的 DNA 结构，用于细菌（主要是大肠杆菌）的转化和克隆。F 质粒含有分区基因，可确保细胞分裂后质粒的均匀分配。BAC 通常插入的尺寸约为 150-350 kbp。

PAC 是另一种克隆载体，它是由 P1 噬菌体的遗传物质产生的。

BAC 通常用于测序不同生物的基因组，例如人类基因组计划。一种生物体的一小段 DNA 被用作 BAC 中的插入片段，然后进行测序。然后，测序的 DNA 在硅上排列，从而获得该生物体的完整基因组序列。

BAC 已被全基因组鸟枪法测序和现在的新一代测序所取代。这种演变节省了测序的时间和繁琐的工作。

细菌人工染色体

BAC 在其构建体中包含基本组成部分。

1. 为了复制质粒，BAC 构建体中存在一个拷贝数调控因子 repE。
2. parA 和 par B 用于在细菌细胞分裂过程中将 F 质粒 DNA 分区到子细胞中。它还提供了 BAC 的稳定性和维持。
3. 一种抗生素抗性的选择标记。一些 BAC 菌株还在其克隆位点含有 lacZ，用于区分蓝色或白色菌落。
4. T7 和 Sp6 用作噬菌体启动子，有助于插入基因的转录。它们还被富含 GC 的限制性内切酶位点包围，用于切除。

如何制作 BAC 文库？

要制作 BAC 文库，首先必须分离含有您想要存储的 DNA 的细胞。然后将这些细胞与热琼脂糖溶液混合。

然后将液体混合物倒入模具中，形成一组小盒子，每个盒子包含数千个分离的细胞。然后用特定酶处理这些细胞，以分解它们的细胞壁并将 DNA 释放到琼脂糖凝胶中。

然后添加限制性内切酶将 DNA 切割成长度为 200,000 个碱基对的小片段。然后将 DNA 插入含有孔的梳子中，置于琼脂糖凝胶板上。然后通过电泳过程根据大小分离这些 DNA 片段。

在琼脂糖凝胶板的一侧，插入 DNALadder 或标记物溶液。标记物是已知大小的 DNA 片段，用作参考以识别插入 DNA 片段的大小。

然后，DNA 片段被切下并从凝胶中提取出来。然后使用连接酶将这些提取的 DNA 片段插入细菌人工染色体载体中，连接酶将两段 DNA 连接在一起。现在，我们可以称它们为 BAC 克隆。

这些 BAC 克隆然后被插入宿主细胞，通常是大肠杆菌。然后将细菌分布在营养丰富的平板上，这些平板只允许携带 BAC 克隆的细菌在该培养基上生长。

这些细菌迅速生长，导致细菌细胞数量增加，每个细菌都包含一个 BAC 克隆的拷贝。

在含有 BAC 克隆的细菌生长后，将它们挑选到 96 孔或 384 孔板中，以便每个试管至少有一个 BAC 克隆组成的细菌。

细菌也可以再次复制或通过冷冻储存，以便研究人员以后可以使用 DNA 进行测序。

最后，BAC 文库已被创建。

BAC 对疾病模型的贡献

细菌人工染色体现在正被用于更重要的方面，例如模拟遗传疾病。BAC 在研究中已被证明是有用的，因为它们是复杂的基因，其编码序列上游有许多调控序列，并且存在各种启动子基因，这些基因将导致基因表达。

BAC 也被整合到小鼠中，用于研究神经系统疾病，如阿尔茨海默病，或在某些情况下，如唐氏综合征的非整倍体疾病。

• 它们也被用于研究特定的癌基因以治疗癌症。它们通过转化、电穿孔、显微注射转染或合适的病毒转移到这些遗传疾病模型中。
• BAC 也可用于检测感兴趣的基因或序列，然后使用 BAC 阵列将其映射到人类染色体上。
• BAC 因其易于容纳较大序列而不会导致重排风险，因此更适合此类遗传研究。因此，BAC 比其他类型的克隆载体更稳定。

应用

• BAC 载体已被用于研究大型双链 DNA 病毒以进行学术研究，并作为开发先进疫苗的工具。
• BAC 用于基因组文库的构建。它们已被用于从基础科学研究到工业研究，例如畜牧业。
• BAC 也用于确定不同物种之间的系统发育谱系。
• 它们也用于研究水平基因转移。

BAC 载体的优点

• BAC 载体具有较大的尺寸，有助于最大程度地减少整合位点效应。整合效应被定义为内源性序列被破坏并在基因克隆技术中产生不良序列。
• 内源性基因的表达比其他克隆系统更准确。
• 人类基因组中的 BAC 包含一个完整的结构，在基因调控中起关键作用。因此，人类基因组中的 BAC 在基因转录时提供完整的 mRNA 加工和剪接，并在 mRNA 序列翻译后产生完整的蛋白质异构体。
• BAC 可以转染并在哺乳动物细胞中表达，即使拷贝数和转染率较低。

BAC 载体的局限性

• 由于 BAC 载体具有较大的 DNA 构建体，因此也可能包含非相关基因，这可能导致非特异性直接或不准确的基因表达。这还可能导致细胞表型的未经授权的改变。
• 重组 BAC 构建可能非常耗时耗力。
• BAC DNA 构建体的较大尺寸在转染前的操作过程中很容易降解和破坏。