基因克隆

基因克隆是**基因工程中用于创建特定基因或DNA序列副本的技术。**它允许科学家分离和扩增基因，用于研究、药物开发和提高作物产量。

基因克隆是一种允许研究人员复制和关注单个特定基因，而不是处理整个基因组的程序。由于它能产生相似的基因副本，已成为现代生物技术中不可或缺的工具。

**克隆是通过使用限制性内切酶切割DNA中的所需片段，并将其通过连接反应插入到另一个称为载体的片段中，从而分离和扩增基因的方法。** 这种技术被称为基因克隆、DNA克隆、分子克隆或重组DNA技术，它们都指的是同一件事，科学家们根据他们的偏好或研究领域互换使用。本文介绍了基因克隆及其重要细节。

基因克隆要求（基于细胞）

• 包含用于克隆的所需基因的DNA片段。
• 连接酶和限制性内切酶。
• 载体在宿主细胞中转运、维持和复制克隆的基因。
• 能够复制重组DNA的宿主细胞。

基因克隆的原理和步骤

要克隆一个基因，需要将其插入到作为载体将基因转运到宿主细胞中，在那里载体进行复制并产生自身和基因的副本。细菌通常被用作克隆的宿主细胞，但也可以使用其他活细胞。

在细胞分裂过程中，重组DNA分子会传递下去并在宿主细胞中复制。经过多次分裂后，会产生一个由相同细胞组成的克隆，其中包含一个或多个重组DNA分子的副本，从而实现基因克隆。

基因克隆涉及的步骤

基因克隆有七个重要步骤，如下。

1. 分离用于克隆的DNA片段

• 要克隆一个基因，首先必须将其分离。这包括识别编码所需蛋白质或激素（如胰岛素）的特定DNA片段。
• 可以使用限制性内切酶获得基因，该酶在特定位点切割DNA，产生平末端或粘性末端。
• 逆转录酶可以利用所需基因的mRNA来创建其互补DNA链。

2. 通过将分离的DNA插入载体来创建重组DNA的过程

• 载体是可以将所需基因转运到宿主中并与其一起复制以创建多个副本的分子。
• 在选择克隆载体时，重要的是要考虑插入片段的大小及其预期用途。此外，不同的载体对它们可以携带的插入片段大小有不同的限制。
• 克隆载体包括质粒、噬菌体、BAC、YAC和MAC。
• 主要使用的克隆载体是质粒和噬菌体，例如λ噬菌体。

3. 将重组DNA引入称为宿主的生物体中

克隆载体是具有共同特征的载体DNA分子。

• 它必须在宿主细胞内自我复制。
• 它需要有一个用于RE酶的独特限制位点。
• 确保供体DNA的引入不会破坏载体的复制能力至关重要。
• 重组细胞需要一个标记基因用于识别（通常是宿主细胞中不存在的抗生素抗性基因）。
• 宿主细胞应易于分离。

4. 选择转化宿主细胞并识别含有特定基因的克隆的过程

• 使用与用于分离供体DNA片段相同的限制性内切酶打开质粒载体。
• 将供体DNA片段和质粒载体组合。
• DNA连接酶促进供体DNA片段和质粒载体的碱基配对。
• 创建的DNA分子是两个不同分子的组合，在遗传学中称为重组。
• 将来自不同来源的DNA组合的技术称为重组DNA技术，创建的混合分子称为重组DNA分子。

5. 通过增殖在宿主生物体中表达基因

重组载体主要被转化到合适的宿主细胞中，通常是细菌细胞。

这样做有以下原因：

• 为了复制GI，复制重组DNA分子。
• 实现GI表达以生产所需蛋白质。
• 某些细菌能够无需外部协助自然地摄取重组载体。自然感受态细菌的例子包括芽孢杆菌、流感嗜血杆菌和幽门螺杆菌。
• 某些细菌需要人工方法，如Ca++离子处理和电穿孔来进行整合。

6. 分离多个基因拷贝/蛋白质

• 在转化过程中，会产生转化和非转化宿主细胞。
• 选择过程只涉及过滤转化宿主细胞。
• 使用质粒载体的标记基因将重组细胞与非重组细胞分开。
• 例如，PBR322质粒载体有两个标记基因，氨苄青霉素抗性和四环素抗性。使用pst1 RE酶可以去除质粒中的氨苄青霉素抗性基因，使重组细胞对氨苄青霉素敏感。

7. 基因/蛋白质的纯化

• 在宿主细胞被转化和筛选后，为它们提供最佳的生长和复制条件很重要。
• 在转化过程之后，在此步骤中将修饰的宿主细胞添加到新的培养基中。
• 接下来，分离扩增的GI及其连接的载体或编码的蛋白质。
• 纯化分离的基因拷贝或蛋白质。
• 在此阶段，宿主细胞会经历多轮分裂，同时也会复制它们所含的重组DNA。
• 为了通过载体获得所需的产物，必须为基因表达提供有利的条件。复制宿主细胞足以获得多个目标基因的拷贝。

基因克隆的应用

1. 基因功能：基因功能是DNA和基因分析的重要方面。克隆基因可以确定它们是否存在。

重组质粒可用于确定基因的功能，以及进行基因敲除、敲低和转基因创建。PCR是一种有效、快速且经济的技术，通过Taq DNA聚合酶进行扩增或合成基因，已取代了传统的基因克隆方法。

2. 基因结构：克隆可用于识别和测序特定基因的结构，从而分析其序列的变异。

3. 构建转基因生物：基因克隆是通过重组DNA构建转基因生物的流行技术。它包括将转基因插入植物、细菌或小鼠中，以改变其特性和表型，并创建与疾病相关的模型。

4. 基因治疗：基因治疗使用基因克隆来替换或修复受损的DNA序列或基因，用健康的版本替换，为遗传性疾病提供潜在的治疗选择。

5. 突变研究：聚合酶链式反应技术已取代基因克隆用于突变研究和鉴定，因为它更快、更便宜。它也可用于定点诱变研究。

基因的分离和分析可以揭示其核苷酸序列、调控序列和功能特性。这些信息有助于识别与疾病相关的突变，并工程化生物体以达到特定目的，例如胰岛素生产或抗虫性。

6. 生物制药：基因克隆用于创建合成和重组蛋白，包括胰岛素和生长因子。该过程被认为是生物制药领域的一项创新。

基因克隆的局限性

在80年代，DNA克隆是一项重大发现，但它存在局限性和缺点。

• 当前的方法很慢，需要3-4天才能产生结果，因为存在培养和限制性消解等耗时步骤。
• 该技术昂贵且困难，并且存在污染问题。
• 实验准确性和产量较低。

结论

基因克隆是制造DNA副本的过程，但存在局限性。1983年聚合酶链式反应的发明克服了这些局限性，并为基因克隆提供了一种快速、经济、准确且产量高的技术。

PCR是遗传学和基因组学中的强大工具，因为它节省时间、金钱，并且通过产生比传统基因克隆技术更多的DNA副本，使得实验更加容易。

常见问题

1. 基因克隆的主要目的是什么？

克隆是复制DNA的过程，以产生来自其他生物细胞的特定基因的相同副本。这项技术有助于研究人员研究基因如何影响性状，并培育出能抵御害虫的大量转基因作物。

2. DNA连接酶在基因克隆中起什么作用？

DNA连接酶在基因克隆中至关重要，因为它们通过一个称为连接的过程促进细胞分裂期间DNA链的键合。

3. 为什么要在细胞中使用PCR进行基因克隆？

PCR是一种用于扩增DNA模板的技术，通过在特定温度下反复加热和冷却循环，将一个样本中的大量DNA复制到另一个样本中，从而进行分析。