基因敲除法

基因敲除是一种在遗传学研究中用于研究特定基因的作用和意义的有效方法。它涉及有意地破坏或关闭生物体内的特定基因，以研究其后果。基因敲除实验改变了遗传学，也阐明了基因在各种生物过程中的作用。

选择目标基因并鉴定它是基因敲除过程的通常第一步。研究人员可以选择感兴趣的基因，其依据是该基因已知的与疾病相关性、它被认为参与的生物过程，或者仅仅是为了了解其工作原理。在找到目标基因后，下一步是使其失活或损害其正常功能。

尽管存在多种基因敲除方法，但重组DNA技术是最常用的方法之一。在这种方法中，将基因的非功能性或修饰性副本插入到生物体的基因组中。这种修饰通过阻止基因编码功能性蛋白质来“敲除”该基因的活性。

另一种基因敲除技术是使用RNA干扰（RNAi），该技术涉及引入精确靶向并降解目标基因产生的信使RNA（mRNA）的小干扰RNA（siRNA）分子。这会阻止相应蛋白质的产生，从而导致基因敲除。细菌、酵母、植物、哺乳动物以及许多其他类型的生物都可以用于基因敲除研究。CRISPR-Cas9等新型基因组编辑技术的发展提高了基因敲除的可及性和有效性。CRISPR-Cas9能够精确靶向编辑特定基因，使其能够更轻松地在多种动物中进行基因敲除。

基因敲除研究为我们理解基因功能及其在多种生物过程中的作用提供了重要的新见解。通过关闭特定基因，研究人员可以研究由此产生的生物体表型变化。这种方法极大地促进了对对生存至关重要的基因以及与疾病相关的基因的研究。基因敲除研究已经揭示了关于癌症、神经系统疾病和遗传综合征等疾病的遗传基础的重要细节。通过选择性地抑制与这些疾病相关的基因，可以研究其对细胞功能的影响，并发现可能的治疗靶点。

基因敲除与基因敲入的区别

基因敲除是指有意地破坏或灭活生物体基因组中的特定基因，然后研究由此产生的效应。这通常通过插入非功能性或改变的基因副本来实现，这些副本阻止其产生所编码的功能性蛋白质。基因敲除研究的主要目标是理解特定基因在生物过程中的重要性、功能和参与度。由于它阐明了基因的正常功能、与疾病的相关性以及潜在的治疗靶点，因此有助于研究基因缺失对生物体的影响。

然而，基因敲入是指将外源基因或其他遗传物质添加到生物体的基因组中。可以插入来自其他生物的基因、原始基因的修饰版本或全新的基因。基因敲入旨在引入新的遗传物质并监测生物体对其的反应。利用这种方法，科学家可以检查基因插入的效果，例如新蛋白质的表达或现有生物通路的变化。

通过用修饰版本替换正常基因或插入一个更易于查看和跟踪基因表达的报告基因，基因敲入经常被用于研究基因如何工作。这种方法极大地有助于研究基因表达调控、蛋白质定位和蛋白质-蛋白质相互作用。基因敲入还可以通过将疾病相关的突变引入基因组并分析其对生物体表型和细胞功能的影响来模拟遗传疾病。

随着基因组编辑技术的发展，基因敲除和基因敲入两种方法的原理都发生了变化。CRISPR-Cas9是目前最流行的基因组编辑方法，它能够对基因敲除和基因敲入实验中的基因组进行精确和有针对性的修改。CRISPR-Cas9能够编辑特定的基因组区域，实现精确有效的基因修改。

基因敲除的机制

第一步是制作一个与目标基因DNA序列互补的sgRNA。然后产生Cas9酶，并将sgRNA与其结合。之后，sgRNA-Cas9复合物将Cas9酶引导至目标基因，并在特定位置引入双链断裂。

这些断裂会触发细胞固有的DNA修复系统，即非同源末端连接（NHEJ）。NHEJ可以修复断裂，但在此过程中经常会产生错误或小的插入/缺失（indels）。这些indel可能导致移码突变，改变基因的读取框架，使其无法发挥功能。

同源重组和CRISPR/Cas9方法都会导致目标基因的破坏或消除，这相当于将其敲除。然后，通过研究改变的细胞或生物体，可以确定改变基因的功能及其缺失的表型效应。

小鼠和其他生物中的基因敲除

同源重组：在小鼠等真核生物中，基因敲除通常通过同源重组来实现。这种方法将经过特殊设计的、序列与目标基因相似的DNA构建体引入生物体细胞。为了便于识别和分离成功发生重组的细胞，该构建体通常包含一个选择标记基因，例如抗生素抗性基因。

该过程以将DNA构建体插入细胞开始，在那里它通过同源序列与目标基因发生重组。这种重组事件导致选择标记基因取代或破坏目标基因。之后，细胞暴露于选择条件下，例如暴露于抗生素，以便识别和分离整合了该设计的细胞。

小鼠基因敲除：由于小鼠在遗传上与人类相似且易于进行基因操作，因此它们长期以来一直是遗传研究的首选模式生物。小鼠基因敲除是指通过同源重组或CRISPR-Cas9等方法选择性地破坏特定基因。为此，可以将阻止基因表达或使其失活的突变引入目标基因。

如果研究人员能够选择性地禁用一个基因，他们就可以在体内研究该基因的功能。通过观察小鼠出现的表型变化，可以了解该基因在各种生物过程中的功能，例如发育、新陈代谢、行为和疾病。这些信息有助于我们理解人类遗传学以及癌症、心血管疾病和神经系统疾病等问题的原因。

小鼠以外：尽管小鼠已被广泛用于基因敲除研究，但其他生物在改进遗传研究方面也发挥了重要作用。例如，斑马鱼、果蝇（Drosophila）、线虫（Caenorhabditis elegans）和酵母（Saccharomyces cerevisiae）等模式生物已从基因敲除方法的应用中受益。

这些生物在实验可操作性、快速的世代时间、易于维护以及在短时间内识别表型变化的能力方面具有独特的优势。例如，在斑马鱼和果蝇中，能够在胚胎发育过程中分析基因缺失的影响，这使得对器官形成和疾病模型中基因功能的研究成为可能。

应用

基因敲除的一些主要应用是

基因功能分析：基因敲除经常用于研究特定基因的功能。研究人员可以通过观察选择性地灭活生物体中目标基因所产生的表型变化来确定基因的功能。这种方法有助于理解发育、新陈代谢、行为和疾病背后的分子机制。

疾病模型：在人类疾病的动物模型创建中，基因缺失发挥着至关重要的作用。通过在小鼠或其他物种中选择性地关闭与特定疾病相关的基因，研究人员可以模拟疾病的症状并研究其潜在原因。这些模型有助于识别潜在的治疗靶点，评估新疗法的有效性，并为疾病进展提供关键见解。例如，基因敲除在理解囊性纤维化、亨廷顿病和癌症等遗传性疾病方面发挥了重要作用。

药物靶点识别：基因敲除对于识别潜在的治疗靶点至关重要。通过有选择地抑制参与疾病通路或药物反应的基因，研究人员可以确定哪些基因对于疾病的发生或治疗的有效性至关重要。这些知识有助于发现和开发新药，从而实现能够选择性地改变特定基因或蛋白质活性的靶向疗法。

基因治疗：基因敲除也应用于基因治疗，这是一个快速发展的领域，旨在通过向个体引入或改变基因来治疗或治愈遗传性疾病。通过灭活致病基因或引入治疗性基因，基因敲除有助于创建能够纠正基因突变或恢复正常基因功能的定制疗法。

发育生物学：通过研究小鼠等模式生物中的基因敲除，可以了解胚胎发育中涉及的遗传机制和程序。通过在不同的发育阶段选择性地关闭特定基因，可以揭示组织分化、器官形成和形态发生的遗传调控。这些研究促进了我们对先天性异常和发育问题的理解。

基因调控和信号通路：研究人员可以使用基因敲除来检查信号通路和基因调控网络。通过沉默关键的调控基因或信号级联的组成部分，科学家可以研究基因之间的相互作用，并理解它们如何促进细胞增殖、分化以及对环境刺激的反应等生物活动。

基因敲除方法的优点

基因敲除方法的优点列举如下

基因功能分析：通过检查基因失活的结果，研究人员可以使用基因敲除来检查特定基因的功能。科学家可以通过比较敲除动物与健康个体之间的表型差异来更深入地了解基因的功能。

疾病模型：研究人员可以使用基因敲除技术创建人类疾病的动物模型。通过选择性地抑制与特定疾病相关的基因，科学家可以研究疾病的过程，评估潜在的治疗策略，并开发新药。这对于理解亨廷顿病和囊性纤维化等遗传性疾病非常有益。

靶点验证：敲除实验可以验证拟议的治疗靶点的有效性。当发现某个基因对疾病表型至关重要时，它就成为潜在的治疗开发靶点。基因敲除实验通过为特定靶点提供证据，从而简化了药物发现过程。

基因相互作用研究：研究人员可以通过敲除多个基因来检查它们之间的相互作用。利用这种方法，可以识别支持多种生物活动的不易察觉的遗传关系和通路。了解基因如何相互作用对于破译复杂的生物事件和定位潜在的治疗靶点至关重要。

进化见解：通过对模式生物进行基因敲除研究，可以很好地理解基因及其活动在进化过程中的演变。研究人员可以通过比较不同物种之间基因敲除的表型效应来确定基因功能在进化中的保守性或差异性。

基因敲除方法的缺点

基因冗余：由于许多基因执行相似的任务，因此它们的失活可能不会对表型特征产生重大影响。这种冗余可能会限制敲除结果的可解释性，并且可能难以确定特定基因的确切功能。

脱靶效应：基因敲除技术可能会无意中损害目标基因以外的基因。这可能会产生意想不到的表型效应，并使结果的解释变得困难。为了减少脱靶效应，正确评估基因敲除技术的特异性至关重要。

发育补偿机制：在极少数情况下，生物体可能会激活替代通路或基因来补偿特定基因在发育过程中的缺失。由于这种补偿可能会掩盖基因缺失的潜在表型影响，因此精确确定基因的功能可能具有挑战性。

致死性和必需基因：有些基因对生存至关重要，敲除它们会导致严重的发育缺陷或早期胚胎死亡。此类基因在敲除后可能无法产生，从而限制了基因敲除研究在特定基因上的应用。

伦理考量：特别是在涉及高等哺乳动物时，对动物使用基因敲除程序会引发伦理问题。在可行的情况下，应探索替代技术或体外模型，同时仔细考虑相关动物的福利。