CRISPR基因编辑

CRISPR基因编辑是一种分子生物学技术，允许对生物体的基因组进行修饰。它的发音是“crisper”（/krspr/）。它基于细菌使用的CRISPR-Cas9抗病毒防御系统。通过将与合成引导RNA（gRNA）复合物的Cas9核酸酶引入细胞，可以精确地切割细胞基因组的特定位点，从而在体内添加新基因或删除现有基因。

这项技术在生物技术和医学领域至关重要，因为它能够实现精确、低成本、简单的体内基因组修饰。除了控制疾病和害虫外，它还可以用于创造新型药物、食品和转基因生物。它可能对治疗与体细胞突变相关的疾病（如癌症）以及家族遗传性疾病有益。然而，其在操纵人类种系遗传物质方面的适用性备受争议。这项技术由Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier创造，她们共同获得了2020年诺贝尔化学奖。由Virginijus Iknys领导的第三个研究团队也分享了同一项发现的Kavli奖，尽管他们没有获得诺贝尔奖。

Cas9核酸酶就像一把基因剪刀，通过两种策略之一打开目标DNA序列的两条链以进行改变。目标基因组编辑方法的传统过程涉及同源定向修复（HDR）辅助的插入突变。这使得靶向DNA损伤和修复成为可能。通过使用外源DNA作为修复模板，HDR利用相似的DNA序列促进断裂的修复。要使用此技术启动修复，必须在目标位点发生周期性的、孤立的DNA损伤。CRISPR-Cas9诱导的敲除突变是由非同源末端连接（NHEJ）或POLQ/聚合酶theta介导的末端连接（TMEJ）对双链断裂的修复引起的。末端连接通路通常会导致修复位点的随机插入或缺失，这可能会影响或改变基因的功能。因此，研究人员可以使用CRISPR-Cas9基因组工程来产生定制的随机基因破坏。因此，基因组编辑的准确性是一个主要问题。基因组编辑会不可逆地改变基因组。

自20世纪80年代以来，已经有多种技术可以对真核细胞的基因组进行修饰。然而，这些技术被证明效率低下且难以大规模使用。CRISPR的发现，特别是Cas9核酸酶的发现，使有效且极其选择性的编辑成为现实。来源于化脓性链球菌的Cas9，通过提供一种可靠的方法在crRNA和tracrRNA引导链指示的特定位置产生断裂，从而实现了对真核细胞中靶向基因组修饰。使用Cas9和模板RNA在特定位点沉默或产生单点突变的便利性，使得在多种真核生物中能够快速有效地绘制与不同基因相关的基因组模型和生物学过程图谱。经过近期工程改造的Cas9核酸酶变体，能够显著降低脱靶活性，已被开发出来。

CRISPR-Cas9基因编辑技术在农业和健康领域有许多潜在的应用。AAAS将CRISPR-Cas9-gRNA复合物的基因编辑选为2015年的年度突破。然而，使用CRISPR进行种系编辑的理念引发了许多生物伦理问题，特别是在应用于人类胚胎时。

基因组工程

使用CRISPR-Cas9进行基因组编辑可以通过II型CRISPR系统实现。当用于基因组编辑时，该系统包含一个由Cas9、crRNA和tracrRNA组成的核糖核蛋白（RNP），以及一个可选的DNA修复模板。通常使用包含RNP组成部分的质粒通过CRISPR-Cas9转染靶细胞，或者在将RNP提供给细胞进行核转染之前将其构建好。该质粒的基本组成部分在表格和图片中都有列出。crRNA是为每个应用特别设计的，作为Cas9用于识别和直接结合宿主细胞DNA内特定序列的序列。crRNA只能结合到要编辑的区域。每个应用的修复模板都是专门设计的，因为它需要部分互补切割两侧的DNA序列，并包含插入宿主基因组所需的序列。

通过将多个crRNA与tracrRNA结合，可以生成单引导RNA（sgRNA）。这种sgRNA可以与编码Cas9蛋白的基因一起进行转染到细胞的质粒中。有各种在线资源可用于生成有效的sgRNA序列。

结构

CRISPR-Cas9提供了高度的准确性和非常简单的构建。它的特异性取决于目标序列和前间隔相邻基序（PAM）序列。crRNA阵列中目标序列的长度为20个碱基。典型的crRNA阵列包含多种不同的目标序列。Cas9蛋白通过利用该序列与宿主DNA的碱基对形成键合，来选择宿主基因组上的合适位置。该序列可以被改变并独立生成，因为它不是Cas9蛋白的一部分。

Cas9识别宿主基因组上的PAM序列。很难将Cas9改变为识别不同的PAM序列。例如，SpCas9的PAM序列是5'-NGG-3'，在人类基因组中大约每8到12个碱基对出现一次，所以这最终并不太受限制。它通常也是一个相当简短和通用的模式，在基因组的许多位置反复出现。

Cas9蛋白在与质粒共转染到细胞后，在crRNA的帮助下定位到宿主细胞DNA中的正确序列。根据Cas9变体的不同，Cas9蛋白随后在DNA的正确位置产生单链断裂或双链断裂。

响应正确间隔的单链断裂，宿主DNA可以进行同源定向修复，与双链断裂后通常发生的非同源末端连接相比，这种修复不易出错。通过提供DNA修复模板，可以在基因组中的精确位置插入特定的DNA序列。修复模板应在Cas9诱导的DNA断裂处延伸40到90个碱基对。目标是利用细胞的本地HDR过程，该过程将利用提供的修复模板将新序列整合到基因组中。这个新代码现在已经集成到细胞的遗传物质中，并传递给细胞的子代细胞。

配送

可以使用病毒和非病毒技术将Cas9、sgRNA和相关复合物递送到细胞中。对DNA、RNA或核糖核蛋白复合物进行电穿孔是一种常见方法，但可能对靶细胞产生负面影响。还通过化学方法，利用基于脂质和多肽的转染技术，将sgRNA与Cas9一起引入细胞。还通过基于纳米粒子的递送实现了转染。更难转染的细胞类型，如干细胞、神经元和造血细胞，需要更有效的递送策略，例如基于慢病毒（LVs）、腺病毒（AdV）和腺相关病毒（AAV）的策略。

当提供组装好的各种系统组件（如完整的CRISPR/Cas9结构到Cas9-gRNA复合物）而不是使用转基因时，已观察到CRISPR-Cas9的效率显著提高。这在转基因作物的大规模商业化中尤其有价值。由于不需要宿主的复制机制来制造这些蛋白质，sgRNA几乎不可能识别其序列，从而降低了脱靶效应的可能性。

受控基因组编辑

CRISPR-Cas9系统一直在不断发展，目标是提高使用控制性。目前正在进行研究，以特别提高该系统编辑能力的特异性、有效性和粒度。技术修改的系统部分允许对技术进行进一步的分类和划分。这些包括修改sgRNA、创建新的Cas蛋白变体、使用完全不同的效应蛋白，或应用算法技术来找到已经存在的理想解决方案。

CRISPR-Cas9系统需要更精确，因为其脱靶效应会对细胞基因组产生不利影响，应谨慎使用。因此，最大化系统安全性意味着最小化脱靶效应。具有与原始SpCas9相当的效率和特异性的效应蛋白，可以靶向以前未经开发的序列，以及一种几乎没有脱靶突变的变体，是提高特异性的新型Cas9蛋白修饰的例子。此外，还进行了创建新型Cas9蛋白的研究，其中一些部分用DNA取代了crRNA中的RNA核苷酸，另一些则使用结构引导方法来创建脱靶效应更少的Cas9突变体。研究表明，高度稳定的gRNA和迭代缩短的sgRNA也能减少脱靶效应。为了预测亲和力并为系统开发独特的序列以最大化目标特异性，已经应用了机器学习等计算技术。

几种CRISPR-Cas9变体支持基因组编辑或基因激活，使用外部触发器，如光或小分子。其中包括通过将响应光线的蛋白伴侣与激活域和dCas9融合来激活基因的光激活CRISPR系统，或通过将相关的响应光线域与两个分裂Cas9构建体融合，或通过用被笼罩的非天然氨基酸修饰Cas9，或通过用光可裂解互补序列修饰引导RNA来修饰基因组。

可以使用对4-HT有响应的intein连接Cas9s，或在添加4-羟基他莫昔芬（4-HT）时激活结合和切割的全变构Cas9s，或当与四个ERT2域融合时对4-HT有响应的Cas9s来调节小分子基因组编辑。

通过雷帕霉素激活的分裂Cas9系统和与FRB和FKBP片段融合的两个分裂Cas9构建体允许Cas9片段二聚化。在其他研究中，已成功通过小分子链霉素诱导Cas9转录。此外，小分子化合物还可以用于增强同源定向修复，通常是通过阻断非同源末端连接通路。可以使用对4-HT有响应的intein连接Cas9s，或在添加4-羟基他莫昔芬（4-HT）时激活结合和切割的全变构Cas9s，或当与四个ERT2域融合时对4-HT有响应的Cas9s来调节小分子基因组编辑。通过雷帕霉素激活的分裂Cas9系统和与FRB和FKBP片段融合的两个分裂Cas9构建体允许Cas9片段二聚化。在其他研究中，已成功通过小分子链霉素诱导Cas9转录。此外，小分子化合物还可以用于增强同源定向修复，通常是通过阻断非同源末端连接通路。

为了精确地改变目标序列中的一个或两个碱基，CRISPR还使用单碱基对编辑蛋白。最初，它与只能将C变为T和G变为A突变的特殊酶结合。最终，这可以在无需DNA切割的情况下完成。通过与另一种酶融合，CRISPR-Cas9碱基编辑方法还可以将C变为G及其逆向。

CRISPR筛选

在引导核糖核酸（gRNA）可以与前间隔相邻基序（PAM）序列结合的任何地方，CRISPR/Cas9系统（一种基因编辑技术）都可以引起双链断裂（DSBs）。Cas9活性位点突变体，通常称为Cas9镍酶，也可以引起单链切口。通过仅改变gRNA的序列，就可以将Cas9核酸内切酶递送到目标基因并产生DSBs。Cas9核酸内切酶的有效性和基因靶向的简便性，使得CRISPR基因敲除（KO）文库（可覆盖特定基因集或全基因组）在小鼠和人类细胞中的发明成为可能。CRISPR筛选使科学家能够在活体模型生物中进行高通量、系统的遗传破坏。这种遗传破坏对于全面理解基因功能和表观遗传调控是必需的。汇集式CRISPR文库能够同时靶向更多基因。

敲除文库包含抗生素或荧光选择标记，可用于识别转导的细胞，并设计成在所有表达的gRNA之间实现公平的代表性和性能。CRISPR/Cas9文库中存在两种质粒系统。第一种是全能质粒，其中转染的细胞同时产生sgRNA和Cas9。第二种方法使用两种载体，独立递送Cas9和sgRNA质粒。至关重要的是，使用病毒转导将数千种不同的含sgRNA载体以低感染复数（MOI）递送到单层细胞中；这降低了单个细胞克隆接收多种sgRNA的可能性，并防止了基因型-表型分配错误。

为了确定sgRNA的数量，需要进行深度测序（NGS，二代测序）PCR扩增的质粒DNA。因此，该文库可以感染目标细胞，随后可以根据表型进行选择。正选择和负选择有两种类型。负选择能有效检测死亡或生长缓慢的细胞。它可以找出对生存至关重要的基因，然后可以用于发现潜在的药物靶点。另一方面，正选择导致具有生长优势的随机突变群体。选择后，使用NGS收获并测序基因组DNA。对每个sgRNA相关的目标基因进行注释，并与原始sgRNA文库比较，确定sgRNA的耗竭或富集情况。然后通过统计分析找到与期望表型显著相关的基因。

应用

疾病模型

在遗传学领域，Cas9基因组编辑使得快速有效地产生转基因模型成为可能。为了模拟疾病的传播以及细胞对感染的反应和防御，可以将Cas9与sgRNA一起通过质粒转染轻松地引入靶细胞。Cas9能够被体内导入，这使得能够创建更准确的基因功能和突变后果模型，同时避免了早期基因工程技术中常见的脱靶突变。

CRISPR和Cas9带来的基因组建模革命不仅限于哺乳动物。Cas9的引入提高了传统基因组模型的精度，例如果蝇（Drosophila melanogaster），它是最初的模型物种之一。Cas9利用细胞特异性启动子来实现受控的Cas9使用。由于Cas9酶仅影响特定细胞类型，因此它为治疗疾病提供了一种精确的方法。为了增强治疗效果，也可以取出正在接受Cas9治疗的细胞并将其重新植入。

在生物体发育的任何阶段，CRISPR-Cas9都可以用于体内编辑活体生物的DNA，并去除特定的基因甚至整个染色体。

人类染色体14和21，分别在胚胎干细胞系和非整倍体小鼠中，以及成年实验室小鼠的Y和X染色体，都已通过CRISPR技术成功地在体内被去除。这种方法可能有助于解决由染色体数目异常引起的遗传疾病，如唐氏综合征和间性疾病。

包括大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、白色念珠菌（Candida albicans）、甲烷醋菌（Methanosarcina acetivorans）、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）、拟南芥（Arabidopsis spp）、斑马鱼（Danio rerio）和家鼠（Mus musculus）在内的多种模式生物，都已成功地使用CRISPR-Cas9在体内进行基因组修饰。基础生物学研究、疾病模型的开发以及疾病模型的实验治疗都取得了成功。

脱靶效应（编辑了目标基因以外的基因）引起了人们的担忧，认为它们可能会歪曲CRISPR基因编辑实验的结果（即，报告的表型改变可能不是由改变目标基因引起的，而是由其他基因引起的）。CRISPR已经进行了修改，以降低脱靶效应的可能性。通常建议进行正交CRISPR实验来验证基因编辑研究的结果。

CRISPR使得制造模拟疾病或展示基因被敲低或改变时会发生什么的转基因生物变得更加容易。CRISPR可用于非种系细胞进行局部修饰，只影响生物体内的特定细胞群；或者可用于种系层面，制造出目标基因在整个生物体（即，多细胞生物的所有细胞、组织和器官）中都被修改的动物。

CRISPR可用于开发与疾病相关的人类细胞模型。例如，利用人类多能干细胞，CRISPR已被用于特异性诱导与FSGS和PKD（或多囊肾病）相关的基因突变。由这些CRISPR修饰的多能干细胞产生的肾脏类器官显示出疾病特异性特征。由具有PKD突变的干细胞制成的肾脏类器官，在肾小管中形成了大的、透明的囊肿。这些囊肿具有生长到一厘米直径的宏观尺寸的潜力。在具有与该疾病相关基因突变的肾脏类器官中，参与FSGS的过滤细胞——足细胞——显示出连接异常。这与足细胞无法在相邻细胞之间产生微绒毛有关。重要的是，具有相似遗传背景但没有CRISPR改变的对照类器官缺乏这些疾病特征。

通过类似的方式，在由多能干细胞产生的致心肌细胞中模拟了长QT综合征。这些CRISPR创建的具有单基因背景对照的细胞模型为研究人类疾病和评估药物提供了一种新方法。

生物医学

许多人类疾病，特别是那些具有遗传基础的疾病，已被建议作为使用CRISPR-Cas技术治疗的候选。由于其DNA序列修改能力，它是一种纠正导致疾病的突变的有潜力的工具。早期使用动物模型的研究表明，基于CRISPR的疗法有潜力治疗多种疾病，包括癌症、早衰症、β-地中海贫血、镰状细胞病、血友病、囊性纤维化、杜氏肌营养不良症、亨廷顿舞蹈病、转甲状腺素淀 Makarna蛋白淀粉样变性和心脏病。此外，CRISPR已被用于治疗疟疾蚊子，这可能会根除该疾病的传播媒介和人类受害者。

此外，CRISPR在组织工程和再生医学中也有应用，例如开发不含MHC II类蛋白的人体血管，这些蛋白经常导致移植排斥。此外，CRISPR-Cas9技术在治疗人类患者的β-地中海贫血和镰状细胞病临床试验中也显示出希望。然而，该技术在基因治疗中的应用仍存在一些限制：需要目标位置附近存在PAM序列，CRISPR引起的双链断裂引起的p53介导的细胞凋亡，以及由于递送机制通常是病毒而引起的免疫原性毒性。