分子生物学

分子生物学是生物学的一个子领域，它研究细胞内和细胞间生物活动的分子基础，例如生物分子的合成、修饰、过程和相互作用。

尽管细胞和其他微观结构早在18世纪就被发现在生物体中，但直到20世纪，随着物理学和化学技术的进步足以应用于生物科学，人们才对支配它们行为的机制和相互作用有了深入的了解。 “分子生物学”一词最早由英国物理学家威廉·阿斯特伯里（William Astbury）于1945年提出，他将其描述为一种旨在揭示生物现象根源的科学方法——即揭示生物分子的物理和化学结构及性质，以及它们与其他分子的相互作用，以及这些相互作用如何解释所谓的经典生物学观察，而经典生物学则在更大的尺度上研究生物过程。

1953年，弗朗西斯·克里克（Francis Crick）、詹姆斯·沃森（James Watson）、罗莎琳·富兰克林（Rosalind Franklin）及其在医学研究委员会实验室（Medical Research Council Unit, Cavendish Laboratory）的同事首次描述了脱氧核糖核酸（DNA）的化学结构的双螺旋模型，这被认为是新兴领域的一个里程碑事件，因为它为理解先前模糊的核酸作为生物遗传物质的观念提供了物理化学基础。他们基于富兰克林早期的研究提出了这一结构，该研究由莫里斯·威尔金斯（Maurice Wilkins）和马克斯·佩鲁茨（Max Perutz）与他们分享。他们的研究结果在其他微生物、植物和动物中发现了DNA。

分子生物学领域涉及有助于科学家了解分子过程的方法。这些策略被用于有效地靶向新药物、诊断疾病以及更深入地理解细胞生理学。分子生物学衍生的一些临床研究和医学干预措施被归类为基因疗法，而分子生物学或分子细胞生物学在医学中的应用现在被称为分子医学。

分子生物学史

分子生物学位于生物化学和遗传学的交汇处；随着这些科学学科在20世纪的兴起和发展，人们越来越清楚地认识到它们都致力于理解支撑关键生物功能的分子机制。分子生物学的发展与新技术的发明和优化密切相关。许多科学家的工作为分子生物学带来了启示，理解这些人和他们的实验对于理解该领域历史至关重要。

遗传学研究的起源是为了理解控制繁殖和遗传的原则集合，以及被称为基因的假定遗传单位的性质。格雷戈尔·孟德尔（Gregor Mendel）在1866年开创了这项工作，当时他首次揭示了他在研究豌豆杂交试验时发现的遗传原则。分离定律（law of segregation）就是一种遗传定律，它声称二倍体个体对某个特定基因有两个等位基因，它们会将其中一个等位基因传递给后代。由于他开创性的工作，遗传学研究现在经常被称为孟德尔遗传学。

DNA结构发现是分子生物学的一个转折点。瑞士生物化学家弗里德里希·米歇尔（Friedrich Miescher）于1869年开始这项研究，提出了一种名为核酸（nuclein）的结构，该结构今天被称为（脱氧核糖核酸）或DNA。他通过检查脓性绷带的成分并注意到“含磷物质”的独特特征，发现了这种独特的物质。DNA模型的重要贡献者菲布斯·莱文（Phoebus Levene）通过对酵母的生化研究，于1919年提出了DNA的“多核苷酸模型”。埃尔温·查尔加夫（Erwin Chargaff）于1950年改进了莱文的发现，揭示了核酸的几个重要特征，包括不同物种的核酸序列不同。其次，嘌呤（腺嘌呤和鸟嘌呤）的总浓度等于嘧啶（胞嘧啶和胸腺嘧啶）的总浓度。这现在被称为查尔加夫规则（Chargaff's Rule）。1953年，詹姆斯·沃森和弗朗西斯·克里克在罗莎琳·富兰克林的X射线晶体学工作的基础上，揭示了DNA的双螺旋结构，该工作由莫里斯·威尔金斯和马克斯·佩鲁茨告知他们。沃森和克里克描述了DNA的结构，并推测了其独特结构对于潜在DNA复制机制的意义。沃森和克里克与威尔金斯一起，因提出DNA结构模型而于1962年获得了生理学或医学诺贝尔奖。

1961年，人们证明了当一个基因编码一个蛋白质时，蛋白质的每个连续氨基酸都由基因DNA的三个连续碱基指定。因此，遗传密码是三联体密码，每个三联体（称为密码子）指示一个特定的氨基酸。此外，还证明了编码蛋白质的DNA序列中的密码子不重叠，并且每个序列都从预定的起点读取。1962年至1964年间，利用细菌病毒的条件致死突变体，在理解DNA复制、DNA修复、DNA重组和分子结构组装的机制中使用的蛋白质的功能和相互作用方面取得了根本性进展。

格里菲斯实验

1928年，弗雷德里克·格里菲斯（Frederick Griffith）在肺炎链球菌细菌中发现了一种导致实验大鼠死亡的毒力特性。根据当时流行的孟德尔理论，基因转移只能发生在亲代到子代细胞。格里菲斯提出了另一种解释，声称同代成员之间的基因转移被称为水平基因转移（HGT）。这种现象现在被称为基因转化。

格里菲斯的实验集中在肺炎链球菌细菌上，该细菌有两种菌株：一种是毒性强且光滑的，另一种是无毒性且粗糙的。光滑菌株由于存在一种特定的多糖——葡萄糖和葡糖醛酸胶囊的聚合物——而具有闪亮的外观。由于细菌的多糖包被，宿主的免疫系统无法识别细菌并杀死宿主。无毒性、粗糙菌株缺乏多糖胶囊，外观暗淡粗糙。胶囊的有无由基因决定。光滑菌株和粗糙菌株被分为许多类型，包括S-I、S-II、S-III以及R-I、R-II、R-III。所有这些S和R细菌亚型都产生不同类型的抗原。

艾弗里-麦克劳德-麦卡蒂实验

艾弗里-麦克劳德-麦卡蒂实验（Avery-MacLeod-McCarty experiment）是一项开创性的研究，于1944年进行，该实验证明了DNA而不是蛋白质在细菌中传递遗传信息。奥斯瓦尔德·艾弗里（Oswald Avery）、科林·孟罗·麦克劳德（Colin Munro MacLeod）和马克林·麦卡蒂（Maclyn McCarty）使用了一种已知可引起大鼠肺炎的肺炎链球菌菌株的提取物。他们证明，输注提取物中的纯DNA可以引起细菌的遗传改变。他们发现，使用DNase降解提取物中的DNA可以阻止无害细菌转化为致病菌。这提供了DNA是遗传物质的坚实证据，反驳了蛋白质起作用的普遍观点。它为沃森和克里克后来发现其结构铺平了道路。

赫希-蔡斯实验

赫希-蔡斯实验（Hershey-Chase experiment）证明了DNA是引起感染的遗传物质。他们在这项实验中使用了大肠杆菌和噬菌体。这项实验也称为搅拌器实验（blender experiment），因为使用了厨房搅拌器作为主要设备。阿尔弗雷德·赫希（Alfred Hershey）和玛莎·蔡斯（Martha Chase）证明，噬菌体颗粒注入细菌的DNA包含了产生子代噬菌体颗粒所需的所有信息。他们在两个独立的试管中，使用放射性同位素标记了噬菌体的蛋白质外壳（放射性硫）和DNA（放射性磷）。将噬菌体和大肠杆菌混合在试管中后，开始孵育期，在此期间噬菌体改变大肠杆菌细胞中的遗传物质。

然后将混合物搅拌或混合，以将噬菌体与大肠杆菌细胞分离。对整个混合物进行离心，检查含有大肠杆菌细胞的沉淀物，并丢弃上清液。大肠杆菌细胞显示出放射性磷，表明改变的物质是DNA而不是蛋白质外壳。

改变的DNA与大肠杆菌的DNA结合，放射性仅在噬菌体DNA上检测到。这种改变的DNA可以向下代传递，从而产生转导理论（Transduction theory）。转导是将细菌DNA携带噬菌体片段并将其传递给下一代的这个过程。这是一种水平基因转移。

梅塞森-斯塔尔实验

梅塞森-斯塔尔实验（Meselson-Stahl experiment）是分子生物学的一个里程碑，它证明了DNA的半保留复制。马修·梅塞森（Matthew Meselson）和富兰克林·斯塔尔（Franklin Stahl）于1958年进行了一项实验，其中大肠杆菌在含有重氮同位素（15N）的培养基上培养了多代。这导致所有新合成的细菌DNA都与重同位素结合。在细菌在含有普通氮（14N）的培养基中复制后，在不同时间点收集了样本。然后将这些样本在密度梯度中离心，根据密度分离DNA分子。结果显示，在14N培养基中复制一代后，DNA在纯15N DNA和纯14N DNA之间形成了一个中间密度带。这支持了沃森和克里克关于半保留DNA复制的提议，即亲代DNA分子的每一条链都作为新互补链合成的模板，产生两个子代DNA分子，一个亲代DNA分子和一个新合成的DNA分子。

梅塞森-斯塔尔实验为半保留DNA复制提供了坚实的证据，这对于我们对遗传学和分子生物学的认识至关重要。

现代分子生物学

在2020年代初期，分子生物学经历了一个由垂直和水平技术进步共同驱动的黄金时期。垂直方向上，现代技术能够以原子级别实时监测生物过程。分子生物学家现在可以获得更便宜、深度不断增加的测序数据，使他们能够开发非模式动物中的新型基因操作方法。同样，合成分子生物学家通过将外部代谢途径引入各种原核和真核细胞系，将促进小分子和大分子的工业生产。

水平方向上，测序数据变得越来越便宜，并且可以应用于各种科学领域。这将加速欠发达国家的产业发展，并增加个人研究人员的获取机会。同样，任何人现在都可以花费不到10,000美元设计和实施CRISPR-Cas9基因编辑研究，用于新生物体，从而加速工业和医学应用的开发。

与其他生物科学的关系

生物化学、遗传学和分子生物学之间的示意性联系。以下列表提供了一个视角，说明分子生物学与其他相关科学之间的跨学科联系。

1. 分子生物学 - 分子生物学是研究生物过程的分子基础，重点关注分子合成、修饰、机制和相互作用。
2. 生物化学 - 生物化学是研究生物体内的化学物质和生理过程。生物化学家主要关注生物分子（如蛋白质、脂质、碳水化合物和核酸）的作用、功能和结构。
3. 遗传学 - 遗传学是研究遗传差异如何影响生物体的学科。遗传学的目标是预测突变、个体基因和遗传关系如何影响表型表达。

研究人员经常将分子生物学方法与遗传学和生化方法相结合。分子生物学的大部分是定量的，最近的研究利用了计算机科学方法，如生物信息学和计算生物学。自2000年代初以来，分子生物学最著名的子领域之一是分子遗传学，它研究基因的结构和功能。

分子生物学为生物学的各个分支提供了信息，包括细胞生物学、发育生物学和进化生物学（种群遗传学和系统发育学）。生物物理学在从“自下而上”或分子水平研究生物分子方面有着悠久的历史。

分子生物学技术

有关更全面的列表，请参阅核酸技术。

分子克隆

分子克隆是将所需的DNA序列分离出来，然后转移到质粒载体中。重组DNA技术最初创建于20世纪60年代。该技术涉及使用聚合酶链式反应（PCR）和/或限制性内切酶将编码所需蛋白质的DNA序列克隆到质粒（表达载体）中。质粒载体通常包含至少三个区分特征：一个复制起点、一个多克隆位点（MCS）和一个选择标记（通常是抗生素抗性）。位于MCS上游的启动子区域和转录起始位点也控制着克隆基因的表达。

该质粒可以被导入细菌和哺乳动物细胞。DNA可以通过转化（通过摄取裸露DNA）、接合（通过细胞-细胞相互作用）或转导（通过病毒载体）引入细菌细胞。转染（Transfection）是将DNA引入真核细胞（如动物细胞）的过程，可以通过物理或化学方法进行。有几种转染方法可用，包括磷酸钙转染、电穿孔、显微注射和脂质体转染。质粒可能整合到基因组中，从而导致稳定转染，或者它可以独立于基因组存在并仅短暂表达，称为瞬时转染。现在，编码目标蛋白质的DNA代码已存在于细胞内，并可以进行表达。有几种机制可用于帮助以高水平表达目标蛋白质，包括诱导型启动子和特定的细胞信号因子。然后可以从细菌或真核细胞中收获大量蛋白质。该蛋白质可以在各种条件下检测其酶活性，进行结晶以研究其三级结构，或者在制药行业中，可以研究新药物对该蛋白质的活性。

聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（PCR）是一种高度灵活的DNA复制技术。简而言之，PCR允许特定的DNA序列以预定义的方式复制或改变。该反应非常强大，在理想条件下，它可以在不到两个小时的时间内将一个DNA分子放大到10.7亿个分子。PCR有多种应用，包括基因表达分析、病原微生物检测、基因突变检测以及将突变引入DNA。PCR过程可用于在DNA分子的末端插入限制性内切酶位点，或改变DNA的单个碱基，后者是一种称为位点定向诱变（site-directed mutagenesis）的方法。

PCR还可用于确定 cDNA文库中是否存在特定的DNA片段。PCR有多种变体，包括用于RNA扩增的反转录PCR（RT-PCR），以及最近的定量PCR，后者允许对DNA或RNA分子进行定量。

凝胶电泳

凝胶电泳是一种利用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶根据分子大小分离分子的技术。这种方法是分子生物学中的一个关键工具。基本原理是，DNA片段可以通过在凝胶中施加电流来分离；由于DNA骨架包含带负电荷的磷酸基团，DNA会向电流的正极迁移通过琼脂糖凝胶。蛋白质也可以使用SDS-PAGE凝胶根据大小分离，或使用2D凝胶电泳根据大小和电荷进行分离。

布拉德福德蛋白测定法

布拉德福德测定法（Bradford assay）是一种分子生物学技术，它利用一种名为Coomassie Brilliant Blue G-250的染料的特殊性质，快速准确地定量蛋白质分子。当Coomassie Blue与蛋白质结合时，颜色从红棕色变为鲜亮的蓝色。在其不稳定的阳离子状态下，Coomassie Blue的背景波长为465 nm，发出红棕色。当Coomassie Blue在酸性溶液中与蛋白质结合时，背景波长移至595 nm，染料发出鲜亮的蓝光。

测试中的蛋白质在大约2分钟内与Coomassie Blue结合，蛋白质-染料复合物保持稳定约一小时，尽管吸光度值应在反应开始后的5到20分钟内完成。然后可以使用可见光分光光度计测定布拉德福德测定法中的蛋白质浓度，该分光光度计不需要任何额外设备。

马里昂·M·布拉德福德（Marion M. Bradford）于1975年开发了这种方法，与之前的 Lowry 法和双缩脲试验等方法相比，该方法能够更快、更准确地定量蛋白质。与先前的方法不同，布拉德福德测定法不受乙醇、氯化钠和氯化镁等各种非蛋白质分子的影响。然而，它可能会受到十二烷基硫酸钠（SDS）等强碱性缓冲剂的影响。

大分子印迹和探针

“northern”、“western”和“eastern”印迹（blotting）一词起源于一个分子生物学笑话，源自“Southern blotting”一词，指的是埃德温·南方（Edwin Southern）的DNA杂交印迹技术。RNA印迹（后来被称为Northern blot）的创造者帕特里夏·托马斯（Patricia Thomas）并没有使用这个词。

Southern blot

Southern blot，以其发明者、生物学家埃德温·南方（Edwin Southern）命名，是一种用于检测DNA样品中特定DNA序列存在的方法。凝胶电泳在限制性内切酶（restriction endonuclease）消化之前或之后分离DNA样品，然后通过毛细作用将DNA样品印迹到膜上。然后将膜暴露于标记的DNA探针，其碱基序列与目标DNA的序列匹配。由于PCR等其他技术可以从DNA样品中检测特定的DNA序列，Southern blot在实验室科学中的应用已不像以前那么广泛。

这些印迹仍用于某些应用，例如确定转基因小鼠的转基因拷贝数或生成基因敲除胚胎干细胞系。

Northern blot

Northern blot用于比较RNA样品中特定RNA分子的存在。它只是变性RNA凝胶电泳和印迹的结合。在此过程中，RNA按大小排序并转移到膜上，然后用感兴趣序列的标记互补物进行探针分析。结果可以根据使用的标签以多种方式可视化；然而，大多数显示代表样品中RNA大小的条带。这些条带的强度与所分析样品中目标RNA的量成正比。

该过程通常用于通过确定不同样品中RNA的量来研究基因何时以及在多大程度上表达，假设没有转录后调控，并且mRNA水平反映了正在产生的相应蛋白质的比例水平。它是检测活细胞中特定基因何时以及在何种条件下表达的最基本方法之一。

Western blot

Western blot是一种用于检测蛋白质混合物中单个蛋白质的技术。Western blot可用于测量分离的蛋白质的大小并量化其表达。在Western blot中，蛋白质使用称为SDS-PAGE的过程，在两块玻璃板之间拉伸的薄凝胶中按大小分离。然后将凝胶中的蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）、硝酸纤维素、尼龙或其他支撑膜上。然后可以使用抗体溶液对膜进行探针分析。与目标蛋白质结合的抗体随后可以使用多种技术进行可视化，例如有色产物、化学发光或放射自显影。

在许多情况下，酶被用于标记抗体。当化学发光底物暴露于酶时，它变得可检测。Western blot技术可以进行检测和定量分析。使用类似于Western blot的过程，可以直接染色活细胞或组织切片中的特定蛋白质。

Eastern blot

Eastern blot是一种检测翻译后蛋白质修饰的技术。印迹在PVDF或硝酸纤维素膜上的蛋白质用特定底物进行改变测试。

微阵列

DNA微阵列（DNA microarray）是固定在固体基质（如载玻片）上的一系列点，每个点包含一个或多个单链DNA寡核苷酸片段。阵列允许您在单个幻灯片上放置大量非常小的（100微米直径）点。每个区域包含一个DNA片段分子，该分子与一个DNA序列互补。这种技术的一个变体可以在某个发育阶段表征生物体的基因表达（表达谱）。该方法分离组织中的RNA并将其转化为标记的互补DNA。

然后将此cDNA与阵列上的片段进行杂交，并且可以可视化杂交。由于可以使用相同的片段位置创建多个阵列，因此它们在比较两种不同组织（如健康组织和恶性组织）之间的基因表达方面非常有效。还可以量化哪些基因正在表达以及表达如何随时间或对其他变量的反应而变化。

微阵列可以通过多种方法制成，包括硅芯片、带有约100微米直径点的显微镜载玻片、定制阵列和带有较大点（宏阵列）的多孔膜。特定阵列可能包含100个或超过10,000个点。也可以使用DNA以外的分子创建阵列。

等位基因特异性寡核苷酸

等位基因特异性寡核苷酸（ASO）是一种无需PCR或凝胶电泳即可检测单碱基突变的技术。将短的（20-25个核苷酸长）标记探针暴露于非片段化的目标DNA；由于探针的长度短，杂交发生得非常特异，即使单个碱基变化也会抑制杂交。然后洗涤目标DNA，并去除任何未杂交的标记探针。然后使用放射性或荧光测试目标DNA是否存在探针。为了确保成功的测试，这项实验与大多数分子生物学方法一样，需要使用对照。

分子生物学中的程序和技术不断发展，而旧的程序正在被淘汰。例如，在DNA凝胶电泳（琼脂糖或聚丙烯酰胺）出现之前，DNA分子的大小通常是通过蔗糖梯度中的速率沉降来确定的，这是一种缓慢且劳动密集型的技术，需要昂贵的仪器；在蔗糖梯度之前，使用了粘度计。除了其历史意义外，旧技术在解决新问题（对于这些新问题，较新技术无效）方面经常很有用。