色谱法定义

色谱法是一种实验室方法，用于化学分析，将混合物分离成其组成部分。混合物通过一个系统（柱、毛细管、板或片）流动，在该系统中，一种称为固定相的物质在溶解于流动的溶剂（气体或液体）后被固定，这种流动的溶剂称为流动相。混合物的组分在流动流体中以不同的表观速度运动，这导致它们分离，因为它们倾向于对固定相具有不同的亲和力，并且根据它们与固定相表面积的相互作用，在不同时间被保留。流动相和固定相之间的分配差异是分离的基础。分配系数的细微变化导致固定相上的分离，这会影响分离。

出生于意大利的科学家米哈伊尔·茨维特（Mikhail Tsvet）于1900年在俄罗斯首次发明了色谱法。在20世纪的第一个十年，他创建了这种方法并创造了“色谱法”一词，特别是为了分离植物色素，如叶绿素、类胡萝卜素和叶黄素。这些组分直接影响了该技术的名称，因为它们分别分离成不同颜色的条带（绿色、橙色和黄色）。由于色谱法的新形式，该方法在20世纪30年代和40年代对许多分离过程都很有益。

阿彻·约翰·波特·马丁（Archer John Porter Martin）和理查德·劳伦斯·米林顿·辛格（Richard Laurence Millington Synge）的工作促进了各种色谱技术（包括纸色谱法、气相色谱法和后来称为高效液相色谱法）的快速发展。他们开创了分配色谱法的基本概念和程序。此后，技术得到了显著改进。下面提到的各种色谱法的发展归功于研究人员发现茨维特色谱法背后的基本思想可以在多种方式中使用。色谱法的技术性能一直在不断提高，能够分离越来越相似的分子。

• 分析物 - 色谱法中待分离的物质是分析物。此外，它通常是混合物所需要的。
• 色谱仪 - 一种促进复杂分离技术（如液相或气相色谱法）的设备。
• 相 - 色谱法是一种物理分离过程，将组分分成两个相，一个相是固定的，另一个相是流动的并沿特定方向移动。
• 流动相 - 流洗剂，也称为溶剂固定或流动相，是洗脱色谱法中使用的溶剂或溶剂固定。
• 洗脱液 - 刚刚离开色谱柱的溶质和溶剂的混合物称为洗脱液。
• 流出液 - 色谱柱的流出液是离开色谱柱的流。然而，该术语更准确地指的是流，而不管分离是否正在发生。在实践中，它与洗脱液同义使用。
• 洗脱质 - 溶质或分析物的一个更具体的名称是洗脱质。它是已离开色谱柱的物质的一部分。
• 洗脱强度系列 - 洗脱强度系列是一组按洗脱能力排序的溶剂。
• 固定相 - 固定在载体颗粒或色谱柱管内壁上的固定相称为固定相。
• 流动相 - 流动相是沿特定方向运动的相。对于 LC 和毛细管电色谱法 (CEC)，它可以是液体；对于气相色谱法，可以是气体；对于超临界流体色谱法 (SFC)，可以是超临界流体。待分离或分析的样品以及携带样品穿过色谱柱的溶剂构成了流动相。在 HPLC 中，流动相由待分离的样品和一个或多个非极性溶剂组成，例如正相中的己烷或反相色谱法中的甲醇。当流动相穿过色谱柱的固定相时，样品与固定相相互作用并被分离。制备色谱法是使用色谱法大规模纯化化学品以供使用而不是用于分析的过程。
• 保留时间 - 保留时间是在预定条件下，特定分析物穿过系统（从色谱柱入口到检测器）所需的平均时间。查看 Kovats 保留指数。
• 样品 - 在色谱分析中使用的物质。它可能由单个组分或组分组合组成。当样品在分析过程中被处理时，含有目标分析物的相或相称为样品。相比之下，在分析之前或期间从样品中去除的任何不感兴趣的物质都被视为废物。
• 溶质 - 在分配色谱法中，样品组分称为溶质。
• 任何可以溶解另一种物质的材料都是溶剂，而液相色谱法中的液体流动相就是一个例子。
• 固定相 - 在色谱过程中固定的物质称为固定相。例如，薄层色谱法的二氧化硅层。
• 检测器 - 用于定性和定量检测分离后分析物的工具称为检测器。

不同类型的色谱法

1. 柱色谱法

在称为柱色谱法的分离方法中，固定床包含在管中。流动相可能在管子中间自由流动，而固体固定相或覆盖有液体固定相的载体填充管子的整个内部体积（填充柱），或者聚焦在管内壁上或沿管内壁（开管柱）。根据样品通过介质的运动速度差异，确定样品的保留时间不同。W. Clark Still 于 1978 年首次提出了一种称为快速柱色谱法的柱色谱法的改进版本。（闪蒸）。除了通过正压驱动溶剂通过色谱柱外，该方法与常规柱色谱法非常相似。与前一种方法相比，更好的分离使得大多数分离可以在 20 分钟内完成。通过将系统连接到检测器和馏分收集器，可以实现自动化。梯度泵使分离更快，溶剂用量更少。

膨胀床吸附使用流化床而不是由填充床产生的固体相。这使得可以去除培养液或破碎细胞悬液的初步澄清步骤，例如离心和过滤。

许多 DNA 结合蛋白对磷酸纤维素具有很强的亲和力，这在磷酸纤维素色谱法中使用。洗脱蛋白质所需的盐量取决于它与 DNA 的相互作用程度。

2. 纸色谱法

在纸色谱法过程中，将样品溶液的点或线涂在色谱纸条上。将装有少量溶剂并密封的容器覆盖在纸上。由于纸中的纤维素是极性的，极性较弱的化学物质将进一步通过混合物。

3. 薄层色谱法 (TLC)

薄层色谱法 (TLC) 是一种流行的实验室技术，用于根据各种生化物质对固定相和流动相的吸引力来分离它们。它在某些方面类似于纸色谱法。由于每次分离都在新涂层上进行，因此交叉污染的可能性很小。与纸色谱法相比，它具有运行速度更快、分离度更高、定量分析更好以及吸附剂种类更多等优点。高效薄层色谱法可用于更快地分离，使用更少的溶剂，甚至具有更好的分辨率。

4. 溶移色谱法

溶移色谱法的基本原理是，所有具有较低结合亲和力的分子都可以被置换剂置换，置换剂是一种对色谱基质具有高亲和力的分子，可以有效竞争结合位点。色谱法的两种类型——溶移和洗脱——与彼此非常不同。在洗脱模式下，化学品通常以尖锐的高斯峰形式离开色谱柱。为了最大程度地纯化，通常需要宽分离的峰，最好是基线分离。许多变量会影响混合物的任何组分在洗脱模式下沿色谱柱下降的速度。

但生物分子与色谱基质之间必须存在一些显著的相互作用差异，才能使两个化合物以不同的速率移动，从而得以分离。为了最大化这种变化的效应，会调整操作参数。在许多情况下，梯度洗脱和低载量是分离峰基线的唯一方法。

5. 气相色谱法

气相色谱法 (GC)，通常称为气液色谱法 (GLC)，是一种使用气体作为流动相的分离方法。用于气相色谱分离的色谱柱总是根据应用不同而“填充”或“毛细管”。填充柱是气相色谱法的标准主力，因为它们成本较低、使用简单，并且通常效果很好。尽管成本更高，但毛细管柱通常提供更好的分离度，并且越来越受欢迎，尤其适用于复杂混合物。SCOT 柱结合了两种类型的柱，它们在柱壁上附有载体颗粒，但液体相化学键合到它们上。两种类型的色谱柱的材料都是非吸附性和化学惰性的。不锈钢和玻璃通常用于填充柱，而石英或熔融石英则用于毛细管柱。

气相色谱法的基本原理是分析物在通常为基于有机硅的液体相和流动气体之间的分配平衡。一个玻璃或熔融石英制成的毛细管柱，内径为 0.53 至 0.18 毫米，或一个较大的金属管内的固体基质，包含固定相（填充柱）。

6. 液相色谱法

液相色谱法是指以液体作为流动相来分离分子的方法。它可以在柱上或平面上轻松完成。高效液相色谱法是指现代液相色谱法，通常使用非常细的填充颗粒和非常高的压力 (HPLC)。

在这种色谱法中，分子在高压下通过多孔的整体层。该层充当流动相。整体材料是永恒的有机或无机组分块，充当“海绵状色谱介质”。流动相和固定相的极性历来导致 HPLC 分为两个不同的子类。

8. 亲和色谱法

亲和色谱法的基本原理是分析物与特定分子之间的选择性非共价相互作用。虽然不十分牢固，但它非常特异。它经常在生物化学中用于纯化连接有标签的蛋白质。这些标签通常在纯化后被去除，以得到纯蛋白质。色谱柱通常是手动创建的。作为初步步骤，使用常规亲和色谱柱洗去不需要的生物分子。

然而，有一些液相色谱法确实利用了亲和色谱法的特性。基于它们对金属的相对亲和力，可以使用固定化金属亲和色谱法 (IMAC) 来分离上述化合物。这些色谱柱通常可以填充各种金属，以生产具有特定亲和力的色谱柱。

8. 离子交换色谱法

离子交换色谱法，也称为离子色谱法，使用离子交换机制根据分析物相对电荷进行分离。虽然通常在柱中进行，但平面模式也可以有效。传统方法中的固定相是离子交换树脂，其中包含带电官能团，这些官能团与化合物的带相反电荷的官能团相互作用以保留。离子交换色谱法有两种类型：阴离子交换和阳离子交换。虽然阳离子交换色谱法中的固定相带负电荷且阳离子是可交换离子，但在阴离子交换色谱法中，固定相带正电荷，阴离子是可交换离子。

9. 尺寸排阻色谱法

在这种色谱法中，分子根据其个体大小进行分离。该技术也称为凝胶过滤色谱法或凝胶渗透色谱法。较小的分子可以穿过介质的孔隙，因此，较小的分子被截留并从流动相的流动中去除。大于填充物平均孔径的分子被排除，基本上不保留任何东西；这些物种是第一批洗脱的。由于它是一种低分离度的色谱技术，因此通常用作纯化的最后“抛光”步骤。