PCR 的优缺点

PCR 的定义

聚合酶链式反应（PCR）是一种常规用于快速制作特定 DNA 样本数百万至数十亿份拷贝（完整或部分）的方法。借助这种方法，科学家可以扩增微小的 DNA 样本（或其一部分），使其达到足够大的尺寸以进行深入研究。1983 年，美国生物化学家 Kary Mullis 在 Cetus 公司工作期间发明了 PCR。1993 年诺贝尔化学奖授予了 Mullis 和科学家 Michael Smith，后者开发了进一步重要的 DNA 改变方法。

古 DNA 样本的分析和传染性病原体的检测只是众多遗传检测和研究技术中的两个例子，这些技术严重依赖 PCR。通过使用涉及一系列温度变化循环的 PCR，可以指数级地扩增极少量 DNA 样本的拷贝。在医疗实验室研究中，需要广泛的应用，包括生物研究和刑事侦查，通常需要使用 PCR。

PCR 对于许多用于遗传检测和分析的技术至关重要，包括传染性病原体的鉴定和 DNA 样本年龄的计算。PCR 的使用允许通过多个基本变化周期对极少量 DNA 序列的拷贝进行指数级扩增。在各种应用中，例如生物医学研究和刑事侦查，使用 PCR 在医疗实验室检查中正变得越来越普遍，并且通常是必不可少的。

热循环是大多数 PCR 技术的一个关键组成部分。特别是，DNA 熔解和酶驱动的 DNA 双链复制是热循环中两个温度依赖性过程，热循环会使反应物受到影响。

几乎所有的 PCR 应用都使用一种最初从嗜热细菌 Thermus aquaticus 中提取的酶，称为 Taq 聚合酶。如果该聚合酶是热敏感的，则在变性步骤的高温下会使其变性。在使用 Taq 聚合酶之前，必须手动将 DNA 聚合酶添加到每个循环中，这是一项耗时且昂贵的操作。

除了用于测序的 DNA 克隆、基因克隆和操作、基因诱变、DNA 基础的系统发育或基因功能分析的创建、核酸中病原体的检测、古 DNA 的扩增、遗传疾病的诊断和监测、用于测序的基因克隆和操作、基因克隆和操作、基因诱变、基因克隆和操作、基因克隆和操作、用于传染病的古 DNA 分析测试之外，这些都是该技术的一些用途。

在分子生物学中，聚合酶链式反应（PCR）是一种用于制造特定 DNA 区域多个拷贝的方法。美国科学家 Kary Mullis 于 1983 年开发了这一方案。PCR 能够产生微量 DNA 的数百万份拷贝，这已经相当成熟。在分子生物学和生物技术实验室中，这种技术被频繁使用。

PCR 的方面

PCR 的组成部分如下：

DNA 模板：来自样本 DNA 的股。

DNA 聚合酶：使用 Taq 聚合酶。由于其耐热性，极高的温度不会使其变性。

引物寡核苷酸：这些是短的单链 DNA 范围的 3' 端，它们与正义链和反义链互补。

DTTP，或脱氧核苷酸三磷酸：这些是 DNA 合成发生的地方，它们也为聚合提供了稳定性。这些是未配对的碱基。

缓冲系统：在镁和钾的存在下，DNA 变性和复性发生得最有效。它也有助于耐用性、聚合酶迁移率和结合。

PCR 的类型

PCR 可以采用以下形式之一：

实时 PCR：在此样本中，使用荧光标记实时监测 DNA 扩增。荧光报告物的信号强度直接反映了有多少扩增的 DNA 分子存在。

巢式 PCR：其目的是提高灵敏度和特异性。由于非特异性引物结合位点的增强，它们减少了衍生物的非特异性结合。

多步 PCR：使用这种方法，可以在一次 PCR 实验中扩增多个目标。一次扩增多个 DNA 类别。

定量 PCR：该技术利用 DNA 扩增的线性来识别、描述和量化一个类别内的一个隐含类别。

PCR 的优点

PCR 有许多优点。它相对容易使用和理解，并且速度很快。使用一种非常灵敏的方法，可以为测序、克隆和分析生产数百万至数十亿份特定产品的拷贝。qRT-PCR 的优点与 PCR 类似，但还有一个额外的优点是能够量化结果。因此，它在检查肿瘤、细菌或其他疾病状态下的基因表达水平变化方面具有应用价值。

PCR 是一种非常强大且有用的研究工具。PCR 用于确定病因不明的疾病的测序。通过使用这种技术，我们可以更多地了解疾病本身以及与已知病毒相关的先前未发现的病毒的序列。如果该过程能够变得更加简单，并且可以开发出灵敏的非放射性检测技术，PCR 将在未来许多年里在临床实验室中占据重要地位。

• PCR 使得在变性、扩增和复制的连续循环中计算脱氧核糖核酸（DNA）区域的计算变得复杂。
• 使用精确的 DNA 引物可以提示被调查细菌的特征。
• 在分子生物学领域，PCR 也已成为主流，它通过基因识别突变并增强研究人员的相似性。
• 由于调查只需要少量样本，它已更正式地发展成为一种寻找微生物病原体的方法。
• 如今，PCR 的使用仅限于疱疹性角膜炎诊断的确诊。
• PCR 过程大约需要 4-8 小时，比社区治疗早了大约三个小时。
• 多重 PCR 是一种特殊的 PCR 类型，可以同时扩增多个 DNA 类别。由于能够识别 MRSA 产生的许多不同的抗生素基因，它已成为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）诊断的金标准。

PCR 的缺点

PCR 的一个主要缺点是需要预先了解目标序列才能创建能够选择性扩增它的引物。因此，为了确保 DNA 聚合酶正确结合到引物-模板杂交体，并随后在 DNA 合成过程中生成整个目标区域，PCR 用户通常需要了解目标区域上游的两个单链模板上的精确序列。

像其他酶一样，DNA 聚合酶也会犯错误，这会导致生成的 PCR 片段发生突变。PCR 的另一个缺点是，即使只有极少量的污染 DNA，它也可能提供假阳性或不确定的结果。为了减少污染的可能性，研究人员应该在不同的房间进行试剂制备、PCR 和结果分析。应分配一次性使用的试剂分装。建议定期使用带有超长吸头和一次性推杆的移液器。此外，建议在设置实验室时遵循单向流程。切勿将 PCR 或分析室中使用的任何耗材或试剂带入 PCR 制备室，除非首先对其进行彻底的去污。

• PCR 存在一些缺陷。与培养和染色相比，其特异性可能较低，这表明假阳性的可能性更高。在使用复杂的引物来识别多种微生物之前，医生不得不不断列出潜在的微生物，然后才能进行繁琐的操作。PCR
• 为这些传染性角膜炎原因建立的引物主要是 16S 细菌 DNA 引物和 18S 真菌 DNA 引物，这些引物普遍为人所知。由于各种细菌和真菌之间存在内在的相似性，可能会扩增出相互的 DNA，从而在检测到角膜外部环境的正常菌群时产生假阳性。
• 当他们在对照 PCR 分类中发现与同情性疾病无关的微生物时，也存在风险。由于他们的样本是从印度运来的，他们将这一发现与空气污染联系起来。然而，假设这是一个异常发现，或者角膜炎类别更容易受到污染，那么空气传播的污染在 PCR 中是一种罕见的现象。
• 交叉污染在血统和染色中都是一个问题，但理论上 PCR 的灵敏度会增加这种风险。此外，不同地理区域栖息着不同的微生物。
• 在一项为期十年的调查之后，有人报告说，他们地区与 MRSA 相关的角膜炎比其他省份严重得多，这建议临床医生在请求和评估 PCR 结果时考虑地区因素。
• DNA 聚合酶绝非完美，但它们在这方面做得很好。DNA 聚合酶在人体和试管中的 PCR 过程中都会犯错误。Taq 聚合酶是 PCR 中使用的聚合酶之一，它经常缺乏 3' 到 5' 外切酶活性。这种酶缺乏纠正错误整合的核苷酸的能力，而这是在高等真核生物中存在的功能。

结论

PCR 技术用于元条形码调查，结果与传统的非 PCR 取样程序明显不同。因此，(1) 在 eDNA 研究中分配的读数数量与来源生物体的丰度之间没有直接关系，(2) 在 eDNA 研究中分配的读数数量与来源生物体的丰度之间没有一对一的对应关系，(3) 并且 (4) 我们不应期望 eDNA 和传统方法之间在类群丰富度估计中具有持续的高相关性。实验室程序的微小调整可能会导致结果出现巨大差异。考虑到该方法可以在每个样本中揭示数百或数千个类群，并可以轻松地区分不同生境和采样点之间的生物群落，元条形码调查的有用性是不可否认的。为了使 eDNA 成为生态采样数据的常用来源，了解连接扩增子读数与物种生物量或计数的机制至关重要，因为许多实际应用，如渔业储量评估或濒危物种的种群调查，需要某种程度的生物体量化。通过关注生成元条形码数据的方法，我们获得了对这些方法如何（以及如何不能）与其他调查方法进行比较的确切理解，并且在此过程中，我们提供了一种可量化的机制来监测环境样本的变化。